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. 2010 Feb;37(1):21-28.
doi: 10.1159/000265571. Epub 2010 Jan 7.

Obstacles of Multiplex Real-Time PCR for Bacterial 16S rDNA: Primer Specifity and DNA Decontamination of Taq Polymerase

Sebastian Philipp  1 , Hartwig P Huemer, Eveline U Irschick, Christoph Gassner
Affiliations

Obstacles of Multiplex Real-Time PCR for Bacterial 16S rDNA: Primer Specifity and DNA Decontamination of Taq Polymerase

Sebastian Philipp et al. Transfus Med Hemother. 2010 Feb.

Abstract
in English, German

BACKGROUND: The detection of a broad range of bacteria by PCR is applied for the screening of blood and blood products with special attention to platelet concentrates. For practical use it is desirable that detection systems include Gram-positive, Gram-negative and non-Gram-stainable bacteria. It is quite challenging to achieve high sensitivity along with a clear negative control with PCR reagents, because especially Taq polymerase is contaminated with traces of bacterial DNA. METHODS: Bacterial DNA decontamination of Taq polymerase was attempted by two different methods using the restriction enzyme Sau 3A1 and microfiltration. Additionally a commercially available Taq polymerase depleted of bacterial DNA was included. A published real-time PCR specific for Gram-negative bacteria was adapted for Gram-positive bacteria, including certain Staphylococcus species and Mycobacteria, and was used to charge the three Taq polymer-ases depleted of bacterial DNA contamination RESULTS: Despite published reports about successful DNA decontamination, all three approaches performed poorly in experiments done in this study. Sensitivity ranged at approximately 50-100 colony forming units (CFU) per PCR reaction for Escherichia coli and Staphylococcus epidermidis, corresponding to 1,250-2,500 CFU/ml sample material. Conclusion: It seems unsatisfying to accept detection limits that high for diagnostic bacterial PCR even if highly multiplexed. Reliable methods for DNA decontamination of Taq polymerase are needed and would present one important step towards bacterial DNA detection with high sensitivity.

Hintergrund: Die Detektion eines breiten Spektrums verschiedener Bakterien mittels PCR wird bei der Untersuchung von Blut und Blutprodukten eingesetzt und ist bei der Untersuchung von Thrombozytenkonzentraten von besonderem Interesse. Aus praktischen Erwägungen erscheint ein Detektionssystem wünschenswert, das sowohl grampositive und gramnegative, als auch nichtgramfärbbare Bakterien erkennt. Der Wunsch nach hoher Sensitivität bei gleichzeitig eindeutigen Negativkontrollen stellt hierbei eine ganz besondere Herausforderung dar, weil die verwendeten PCR-Reagenzien und ganz besonders die Taq-Polymerase selbst, immer mit Spuren bakterieller DNA verunreinigt sind.

Methoden: Die Abreicherung bakterieller DNA in Taq-Polymerase wurde durch zwei Methoden – den Einsatz des Restriktionsenzyms Sau 3A1 bzw. Mikrofiltration - versucht. Zusätzlich wurde eine kommerziell erhältliche Taq-Polymerase mit angeblich bereits reduziertem Bakterien-DNA-Gehalt in der Studie eingeschlossen. Eine publizierte «Real-time»-PCR-Methode, die vor allem für die Detektion gramnegativer Bakterien geeignet schien, wurde um die Erkennung grampositiver Bakterien erweitert und erlaubte so schlussendlich auch die Detektierung von Spezies der Gattungen Staphylococcus und Mycobacteria. Diese PCR wurde für die Beurteilung der drei verschiedenen Taq-Polymerasen und der Abreicherung bakterieller DNA eingesetzt.

Ergebnisse: Trotz bereits publizierter Berichte über erfolgreiche DNA-Dekontamination enttäuschten alle drei in dieser Studie geprüften Ansätze. Die erreichte Sensitivität lag bei zirka 50-100 Colony Forming Units (CFU) pro PCR-Reaktion für Escherichia coli und Staphylococcus epidermidis, was 1,250-2,500 CFU/ml Probenmaterial entsprach.

Schlussfolgerung: Trotz Mehrfachspezifität der verwendeten diagnostischen PCR erscheinen die erreichten Detektionslimits unbefriedigend hoch. Nach wie vor besteht ein Bedarf an verlässlichen Methoden für die DNA-Dekontamination von Taq-Polymerase, um eine hohe Sensitivität bei der Detektion bakterieller DNA zu erreichen.

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Figures

Fig. 1
Fig. 1
Positioning of a the forward- and b reverse primers: The sequence of parts of the 16S rRNA gene of E. coli is shown. Genetic differences to Mycobacteriae (gray) and Staphylococci (bold) are shown. Homologous regions of human mitochondrial DNA are displayed for illustration. Modifications of primers T lead to an improved detection of mycobacterial DNA (primer 16S-Mtb-F and -R, gray) and gram-positive bacteria (primer 16S-Staph-F and -R, bold).
Fig. 2
Fig. 2
Exemplary amplification plot of different E. coli dilutions. Amplification plots of 1,000, 500, 100, 50 CFU per PCR and negative control (no template control) for PCR cycles 25 to 45 are shown. C(t) = 27.90, C(t) = 29.08, C(t) = 31.21 and C(t) = 33.30 represent 1,000, 500, 100, and 50 CFU/PCR, respectively. C(t) = 34.21 represents the negative control.
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References

    1. Mothershed EA, Whitney AM. Nucleic acid-based methods for the detection of bacterial pathogens: present and future considerations for the clinical laboratory. Clin Chim Acta. 2006;363(1-2):206–20. - PubMed
    1. Barken KB, Haagensen JA, Tolker-Nielsen T. Advances in nucleic acid-based diagnostics of bacterial infections. Clin Chim Acta. 2007;384(1-2):1–11. - PubMed
    1. Zhang T, Fang HH. Applications of real-time polymerase chain reaction for quantification of microorganisms in environmental samples. Appl Microbiol Biotechnol. 2006;70(3):281–9. - PubMed
    1. Corless CE, Guiver M, Borrow R, Edwards-Jones V, Kaczmarski EB, Fox AJ. Contamination and sensitivity issues with a real-time universal 16S rRNA PCR. J Clin Microbiol. 2000;38(5):1747–52. - PMC - PubMed
    1. Rand KH, Houck H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Mol Cell Probes. 1990;4(6):445–50. - PubMed