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. 2019 Dec;53(6):598-609.
doi: 10.1177/0023677219826165. Epub 2019 Feb 13.

Development of an orthotopic syngeneic murine model of colorectal cancer for use in translational research

Jonathan P Evans  1 , Boleslaw K Winiarski  2 , Paul A Sutton  1 , Lorenzo Ressel  3 , Carrie A Duckworth  4 , D Mark Pritchard  4 , Daniel H Palmer  1   5 , Christopher E Goldring  2 , Neil R Kitteringham  2
Affiliations

Development of an orthotopic syngeneic murine model of colorectal cancer for use in translational research

Jonathan P Evans et al. Lab Anim. 2019 Dec.

Abstract
in English, French, German, Spanish

Improving outcomes in colorectal cancer requires more accurate in vivo modelling of the disease in humans, allowing more reliable pre-clinical assessment of potential therapies. Novel imaging techniques are necessary to improve the longitudinal assessment of disease burden in these models, reducing the number of animals required for translational studies. This report describes the development of an immune-competent syngeneic orthotopic murine model of colorectal cancer, utilising caecal implantation of CT26 cells stably transfected with the luciferase gene into immune-competent BALB/c mice, allowing serial bioluminescent imaging of cancer progression. Luminescence in the stably transfected CT26 cell line, after pre-conditioning in the flank of a BALB/c mouse, accurately reflected cell viability and resulted in primary caecal tumours in five of eight (63%) mice in the initial pilot study following caecal injection. Luminescent signal continued to increase throughout the study period with one mouse (20%) developing a liver metastasis. Histopathological assessment confirmed tumours to be consistent with a poorly differentiated adenocarcinoma. We have now performed this technique in 68 immune-competent BALB/c mice. There have been no complications from the procedure or peri-operative deaths, with primary tumours developing in 44 (65%) mice and liver metastases in nine (20%) of these. This technique provides an accurate model of colorectal cancer with tumours developing in the correct microenvironment and metastasising to the liver with a similar frequency to that seen in patients presenting with colorectal cancer, with serial bioluminescent reducing the murine numbers required in studies by removing the need for cull for assessment of disease burden.

L'amélioration des résultats concernant le cancer colorectal (CCR) nécessite une modélisation in vivo plus précise de la maladie chez l'homme, ce qui permet une plus grande fiabilité d'évaluation pré-clinique des thérapies potentielles. De nouvelles techniques d'imagerie sont nécessaires pour améliorer l'évaluation longitudinale du fardeau de la maladie dans ces modèles, afin de réduire le nombre d'animaux requis pour les études translationnelles. Ce rapport décrit le développement d'un modèle murin orthotopique syngénique immuno-compétent de CCR, utilisant l'implantation cæcale de cellules CT26 transfectées de façon stable avec le gène de la luciférase dans les souris BALB/c immuno-compétentes, ce qui permet d'utiliser l'imagerie bioluminescente sérielle pour voir l'évolution du cancer. La luminescence des cellules CT26 transfectées de façon stable, après, pré-conditionnement, dans le flanc d'une souris BALB/c, a clairement reflété la viabilité cellulaire et a donné lieu à des tumeurs cæcales primaires chez 8 des 5 (63%) souris dans l'étude pilote initiale après injection cæcale. Le signal luminescent a continué d'augmenter tout au long de la période d'étude avec une souris (20%) développant des métastases hépatiques. L'évaluation histopathologique a confirmé que les tumeurs étaient compatibles avec un adénocarcinome peu différencié. Nous avons utilisé cette technique chez 68 souris BALB/c immuno-compétentes. Il n'y a pas eu de complications dues à la procédure ni de décès péri-opératoires, avec des tumeurs primaires chez 44 (65%) des souris et des métastases du foie chez neuf (20%) d'entre elles. Cette technique offre un modèle exact du CCR avec les tumeurs se développant dans le microenvironnement correct et se métastasant au niveau du foie avec une fréquence semblable à celle observée chez des patients présentant un cancer colorectal. La bioluminescente sérielle réduit quant à elle le nombre de souris nécessaires dans les études en éliminant la nécessité d'abattage pour évaluer du fardeau de la maladie.

Die Verbesserung der Ergebnisse bei Darmkrebs (CRC) erfordert eine genauere in vivo-Modellierung der Erkrankung beim Menschen, um eine zuverlässigere präklinische Beurteilung potenzieller Therapien zu ermöglichen. Es sind neuartige bildgebende Verfahren notwendig, um die longitudinale Bewertung der Krankheitslast in diesen Modellen zu verbessern und die Anzahl der für translationale Studien benötigten Tiere zu reduzieren. Dieser Bericht beschreibt die Entwicklung eines immunkompetenten syngenetischen orthotopen CRC-Mausmodells unter Verwendung der Zäkumimplantation von CT26-Zellen, die stabil mit dem Luciferase-Gen in immunkompetente BALB/c-Mäuse transfiziert wurden, um eine serielle biolumineszente Darstellung des Krebsverlaufs zu ermöglichen. Die Lumineszenz in der stabil transfizierten CT26-Zelllinie spiegelte nach der Vorkonditionierung in der Flanke einer BALB/c-Maus die Zelllebensfähigkeit exakt wider und führte in der ersten Pilotstudie nach der Zäkuminjektion bei 5 von 8 (63%) Mäusen zu primären Zäkumtumoren. Das Leuchtsignal nahm während des gesamten Untersuchungszeitraums weiter zu, wobei eine Maus (20%) eine Lebermetastase entwickelte. Die histopathologische Beurteilung bestätigte, dass die Tumore mit einem schlecht differenzierten Adenokarzinom übereinstimmen. Wir haben diese Technik nun bei 68 immunkompetenten BALB/c-Mäusen durchgeführt. Es gab weder Komplikationen durch das Verfahren noch perioperative Todesfälle, wobei sich bei 44 (65%) Mäusen Primärtumore und bei neun (20%) von diesen Lebermetastasen entwickelten. Diese Technik bietet ein genaues CRC-Modell mit Tumoren, die sich in der richtigen Mikroumgebung entwickeln und in der Leber mit einer ähnlichen Häufigkeit metastasieren wie bei Patienten mit CRC, wobei die serielle Biolumineszenz die für Studien benötigte Zahl von Mäusen reduziert, da die Notwendigkeit der Tötung zur Beurteilung der Krankheitslast entfällt.

Mejorar los resultados para el cáncer colorrectal requiere una creación más precisa en vivo de modelos de la enfermedad en humanos, lo que permitiría una valoración preclínica más fiable para posibles terapias. Son necesarias nuevas técnicas de creación de imágenes para mejorar la evaluación longitudinal de la carga de la enfermedad en estos modelos, reduciendo el número de animales requeridos para estudios translacionales. Este informe describe el desarrollo de un modelo de murino singenéico ortotópico inmuno competente con un cáncer colorrectal, utilizando la implantación cecal de células CT26 transfectadas establemente con el gen luciferasa en ratones BABB/c inmuno competentes, permitiendo unas imágenes biuluminescentes en serie del avance del cáncer. La luminiscencia en la línea de células CT26 transfectadas, después de un preacondicionamiento en el blanco de un ratón BALB/c, reflejó de forma precisa la viabilidad de las células y provocó tumores cecales primarios en 5 de 8 (63%) de los ratones en el estudio piloto inicial después de una inyección cecal. La señal luminiscente continuó aumentando durante el periodo de estudio con un ratón (20%) desarrollando una metástasis hepática. La evaluación histopatológica confirmó que había tumores consistentes con un adenocarcinoma indebidamente diferenciado. Ahora hemos realizado esta técnica con 68 ratones BALB/c inmuno competentes. No ha habido ninguna compliación con el procedimiento o las muertes perioperativas, con un desarrollo principal de tumores en 44 (65%) de ratones y metástasis hepáticas en nueve (20%) de estos. Esta técnica aporta un modelo preciso de cáncer colorrectar con tumores desarrollándose en el microambinte adecuado y con metástasis hepática con una frecuencia similar a la que se ve en pacientes con cáncer colorrectal, con una bioluminiscencia serial que reduce los números de murinos requeridos en los estudios para eliminar la necesidad de sacrificar demasiados ejemplares para la realización de estudios.

Keywords: bioluminescent imaging; colorectal cancer; orthotopic syngeneic model.

PubMed Disclaimer

Figures

Figure 1.
Figure 1.
Technique for orthotopic injection of tumour cells. (a) Animals were placed in the supine position, the abdomen shaved, sterilised with betadine and sterile-draped. (b) A 1 cm lower midline laparotomy was performed, and the caecum delivered. (c) Tumour cells were injected into the subserosal plane, (d) ensuring a ‘bleb’ of cell suspension was achieved. (e) The wound was closed in two layers.
Figure 2.
Figure 2.
In vitro assessment of CT26lucA6 cells. (a) Kinetic imaging assessment of luminescence in CT26lucA6 cells using IVIS® imaging after the application of in VivoGlo™ firefly luciferin. This curve was generated to guide the timing of imaging after the application of luciferin in subsequent experiments. (n = 3 in triplicate with graph displaying mean +/− SD, min = minutes). (b) Graph demonstrating positive correlation between luminescence and the live cell count per well in CT26lucA6 cells (r = 0.98, p < 0.0001, Pearson R). (c) Image of a 96-well plate demonstrating fall in luminescent signal with decreasing numbers of CT26lucA6 cells. (d) Graphs display stability of luminescent signal in the CT26lucA6c after increasing time in culture.
Figure 3.
Figure 3.
Subcutaneous grafting of the CT26lucA6 cell line in BALB/c mice. (a) Kinetic imaging curves from three BALB/c mice 14 days after the flank injection of CT26lucA6 cells, displaying total flux from the tumour+/− standard error in the mean (SEM) against time after the injection of luciferin. (b) Representative images of three BALB/c immune-competent mice serially imaged in the IVIS® after the subcutaneous (sc) injection of CT26A6 cells. (c) Luminescence signal increased throughout the study period in an exponential manner, as displayed for individual mice in a graph of time versus luminescence. (d) When data were combined the SEM was wide, reflecting the variable growth rates and therefore luminescent signal in mice (n = 6, graph displays mean +/− SEM).
Figure 4.
Figure 4.
Development of the syngeneic orthotopic model. (a) Representative IVIS® images following the caecal injection of CT26lucA6c cells in to BALB/c mice. Imaging was consistent with development of a primary tumour in the left iliac fossa of the mouse, with ectopic signal developing on day 17 in the right upper quadrant, consistent with a liver metastasis. (b) Results were combined as fold-change in luminescence for graphical display, confirming an increase in luminescence throughout the study period. (n = 5, graph displays mean +/− SEM). (c) Three-dimensional spectral un-mixing imaging can be useful for estimating the depth of luminescent signal within the mouse, suggesting luminescent signal arising from within the liver. Ex-vivo assessment confirmed the presence of a liver metastasis, with signal present in both the caecum and liver on IVIS® imaging. (d) Photograph and histology from a caecal carcinoma (marked by an asterisk (*)) excised 18 days after implantation. Histology confirmed tumour growth in the wall of the caecum, originating below the epithelium and invading into the muscularis. LI: lower intestine.
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References

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    1. Ballou B, Ernst LA, Waggoner AS. Fluorescence imaging of tumors in vivo. Current Medicinal Chem 2005; 12: 795–805. - PubMed
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