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. 2019 Sep 1;39(3):547-560.
doi: 10.7705/biomedica.4313.

The Leptin induced Hic-5 expression and actin puncta formation by the FAK/Src-dependent pathway in MCF10A mammary epithelial cells

[Article in English, Spanish]
Raúl Isaías-Tizapa  1 , Erika Acosta, Arvey Tacuba-Saavedra, Miguel Mendoza-Catalán, Napoleón Navarro-Tito
Affiliations

The Leptin induced Hic-5 expression and actin puncta formation by the FAK/Src-dependent pathway in MCF10A mammary epithelial cells

[Article in English, Spanish]
Raúl Isaías-Tizapa et al. Biomedica. .

Abstract
in English, Spanish

Introduction: Leptin is a hormone secreted by adipocytes that has been associated with the epithelial-mesenchymal transition (EMT). Additionally, leptin promotes the migration and invasion of mammary epithelial cells through the activation of FAK and Src kinases, which are part of a regulatory complex of signaling pathways that promotes the expression of proteins related to the formation of proteolytic structures involved in the invasion and progression of cancer. Recently, overexpression and activation of Hic-5 during the EMT have been shown to induce the formation of actin puncta; these structures are indicative of the formation and functionality of invadopodia, which promote the local degradation of extracellular matrix components and cancer metastasis. Objective: To evaluate the role of FAK and Src kinases in the expression of Hic-5 during the epithelial-mesenchymal transition induced by leptin in MCF10A cells. Materials and methods: We used specific inhibitors of FAK (PF-573228) and Src (PP2) to evaluate Hic-5 expression and subcellular localization by Western blot and immunofluorescence assays and to investigate the formation of actin puncta by epifluorescence in MCF10A cells stimulated with leptin. Results: Leptin induced an increase in Hic-5 expression and the formation of actin puncta. Pretreatment with inhibitors of FAK (PF-573228) and Src (PP2) promoted a decrease in Hic-5 expression and actin puncta formation in the non-tumorigenic mammary epithelial cell line MCF10A. Conclusion: In MCF10A cells, leptin-induced Hic-5 expression and perinuclear localization, as well as the formation of actin puncta through a mechanism dependent on the kinase activity of FAK and Src.

Introducción. La leptina es una hormona secretada por los adipocitos que se ha relacionado con el proceso de la transición de epitelio a mesénquima (Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT). Promueve la migración e invasión de las células del epitelio mamario mediante la activación de las cinasas FAK y Src, un complejo regulador de vías de señalización que favorecen la expresión de las proteínas relacionadas con la formación de estructuras proteolíticas implicadas en la invasión y progresión del cáncer. Recientemente, se ha descrito que la sobreexpresión y activación de la proteína Hic-5 durante el mencionado proceso de transición, favorece la formación de los puntos de actina (indicativa de la formación y funcionalidad de los invadopodios), lo cual promueve la degradación local de los componentes de la matriz extracelular y la metástasis del cáncer. Objetivos. Evaluar el papel de las cinasas FAK y Src sobre la expresión y localización subcelular de Hic-5 y la formación de puntos de actina inducida por la leptina en la línea celular MCF10A de epitelio mamario no tumoral. Materiales y métodos. Se utilizaron los inhibidores específicos de la FAK (PF-573228) y la Src (PP2) para evaluar el papel de ambas cinasas en los niveles de expresión y localización subcelular de la proteína Hic-5 mediante Western blot e inmunofluorescencia, así como la formación de puntos de actina mediante la tinción con faloidina-TRITC en células MCF10A estimuladas con leptina. Resultados. La leptina indujo el incremento en la expresión de Hic-5 y la formación de puntos de actina. El tratamiento previo con los inhibidores de las cinasas FAK (PF-573228) y Src (PP2), promovió la disminución en la expresión de Hic-5 y de los puntos de actina en la línea celular MCF10A de epitelio mamario no tumoral. Conclusión. La leptina indujo la expresión y la localización perinuclear de Hic-5 y la formación de puntos de actina mediante un mecanismo dependiente de la actividad de las cinasas FAK y Src en las células MCF10A.

Keywords: Leptin; neoplasms; neoplasm metastasis; actins; epithelial-mesenchymal transition.

PubMed Disclaimer

Conflict of interest statement

Conflicto de intereses: Los autores declaran que durante este trabajo no tuvieron conflicto de intereses alguno.

Figures

Figura 1
Figura 1. Expresión y localización subcelular de la proteína Hic-5 en cultivos de la línea celular MCF10A estimulados con 400 ng/ml de leptina durante 24 horas. A) Western blot de la expresión de la Hic-5, se utilizaron anticuerpos anti-actina β y GAPDH como controles de carga. B) Gráfica correspondiente al análisis densitométrico y estadístico mediante la prueba t de Student. C) Localización subcelular de la Hic-5 por inmunofluorescencia; la línea celular MDA-MB-231 se utilizó como control positivo de la expresión de la Hic-5. Las imágenes fueron procesadas empleando el programa Image J y son representativas de un experimento realizado por triplicado de manera independiente.
Figura 2
Figura 2. La leptina indujo la expresión y la localización subcelular de la proteína Hic-5 dependiente de la actividad de la cinasa FAK en la línea celular MCF10A. Los cultivos celulares se estimularon con 400 ng/ml de leptina durante 24 horas, y se empleó el inhibidor de la cinasa FAK (PF-573228). Condiciones experimentales: control, leptina, leptina + PF y PF-573228. A) Western blot de la expresión de la Hic-5, actina β y GAPDH como controles de carga. B) Gráfica correspondiente al análisis densitométrico y estadístico mediante ANOVA de una vía, empleando una prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls. Significación estadística: *p<0,05. C) Localización subcelular de la Hic-5 por inmunofluorescencia. Las imágenes se procesaron empleando el programa Image J y son representativas de un experimento realizado por triplicado de manera independiente.
Figura 3
Figura 3. La leptina indujo la expresión y la localización subcelular de la proteína Hic-5 dependiente de la actividad de la cinasa Src en la línea celular MCF10A. Los cultivos celulares se estimularon con 400 ng/ml de leptina durante 24 horas, y se empleó el inhibidor de la cinasa Src (PP2). Condiciones experimentales: control, leptina, leptina+PP2 y PP2. A) Western blot de la expresión de Hic-5, actina β y GAPDH como controles de carga. B) Gráfica correspondiente al análisis densitométrico y estadístico mediante ANOVA de una vía, empleando una prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls. Significación estadística: *p<0,05. C) Localización subcelular de la Hic-5 por inmunofluorescencia. Las imágenes se procesaron empleando el programa Image J y son representativas de un experimento realizado por triplicado de manera independiente.
Figura 4
Figura 4. La leptina indujo la formación de puntos de actina dependiente de la actividad de las cinasas FAK y Src en la línea celular MCF10A. Los cultivos celulares se estimularon con 400 ng/ml de leptina durante 24 horas, y se emplearon los inhibidores de las cinasas FAK (PF-573228) y Src (PP2). Condiciones experimentales: control, leptina, PF-573228+leptina, PF-573228, PP2+leptina, PP2. Las células se sembraron sobre una matriz de gelatina bovina para el ensayo de fluorescencia de detección de la actina. Los acercamientos corresponden a los puntos de actina formados como reacción a la leptina. Las imágenes se procesaron empleando el programa Image J y son representativas de un experimento realizado por triplicado de manera independiente.
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References

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