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. 2019 Dec 1;39(4):673-688.
doi: 10.7705/biomedica.4701.

Oxidative stress in endothelial cells induced by the serum of women with different clinical manifestations of the antiphospholipid syndrome

[Article in English, Spanish]
Manuela Velásquez  1 , Manuel Alejandro Granada, Juan Camilo Galvis, Ángela María Álvarez, Ángela Cadavid
Affiliations

Oxidative stress in endothelial cells induced by the serum of women with different clinical manifestations of the antiphospholipid syndrome

[Article in English, Spanish]
Manuela Velásquez et al. Biomedica. .

Abstract
in English, Spanish

Introduction: The antiphospholipid syndrome is characterized by the persistent presence of antiphospholipid antibodies and clinical manifestations of thrombosis or gestational morbidity that are associated with oxidative stress and endothelial dysfunction. Objective: To evaluate markers of oxidative stress in endothelial cells induced by the serum from women with different clinical manifestations of the antiphospholipid syndrome, and to analyze the antioxidant capacity of the sera. Materials and methods: We included 48 women who were classified as follows: presence of antiphospholipid antibodies and clinical criteria of gestational morbidity alone, vascular thrombosis only, and gestational morbidity/vascular thrombosis. Control groups included antiphospholipid antibodies negative women. In an in vitro model of endothelial cells stimulated with sera from women included in the groups, some markers of oxidative stress were determined by flow cytometry. The antioxidant capacity in the sera of these women was analyzed. Results: The sera from the groups of women with antiphospholipid syndrome that presented thrombosis, with or without gestational morbidity, generated a significant increase (p<0.05 and p<0.001) in endothelial oxidative stress markers in contrast to the control of normal human serum. There were no differences in the effect of the sera from the different study groups on endothelial lipid peroxidation. Also, there was also no difference in the antioxidant activity of the sera. Conclusion: Mitochondrial oxidative stress in the endothelium is associated with the presence of thrombosis; instead, its association with gestational morbidity generates intracellular oxidative stress.

Introducción. El síndrome antifosfolípido se caracteriza por la presencia persistente de anticuerpos antifosfolípidos y manifestaciones clínicas de trombosis o morbilidad gestacional, las cuales se asocian con estrés oxidativo y disfunción endotelial. Objetivo. Evaluar los marcadores de estrés oxidativo en células endoteliales, inducidos por el suero de mujeres con diferentes manifestaciones clínicas del síndrome antifosfolípido y analizar la capacidad antioxidante de los sueros. Materiales y métodos. Se incluyeron 48 mujeres que fueron clasificadas así: presencia de anticuerpos antifosfolípidos y criterios clínicos de morbilidad gestacional, trombosis vascular o ambas. Como grupos control se incluyeron mujeres negativas para anticuerpos antifosfolípidos. En un modelo in vitro de células endoteliales estimuladas con los sueros de las mujeres del estudio, se determinaron algunos marcadores de estrés oxidativo por citometría de flujo. También, se analizó la capacidad antioxidante de los sueros incluidos. Resultados. Los sueros de los grupos de mujeres con síndrome antifosfolípido que presentaban trombosis, con morbilidad gestacional o sin ella, generaron un incremento significativo (p<0,05 y p<0,001) en los marcadores de estrés oxidativo endotelial, en contraste con el control de suero humano normal. No se observaron diferencias en el efecto de los sueros de los diferentes grupos de estudio sobre la lipoperoxidación endotelial. Tampoco se encontró diferencia en la actividad antioxidante de los sueros. Conclusión. El estrés oxidativo mitocondrial en el endotelio se asocia con la presencia de trombosis. Sin embargo, cuando esta se asocia con morbilidad gestacional, también se genera estrés oxidativo intracelular.

Keywords: Antiphospholipid syndrome; oxidative stress; morbidity; pregnancy; thrombosis; antioxidants.

PubMed Disclaimer

Conflict of interest statement

Conflicto de intereses: Los autores declaramos que esta investigación se realizó en ausencia de cualquier relación financiera o comercial que se pueda constituir como potencial conflicto de interés.

Figures

Figura 1.
Figura 1.. La expresión de la molécula de adhesión CD31 se conservó estable en las células endoteliales de vena de cordón umbilical humano provenientes de diferentes cordones umbilicales. (A) La molécula CD31 se expresó en más del 99 % de las células endoteliales de diferentes cordones umbilicales. Se muestran tres clonas representativas de diferentes cordones umbilicales utilizados en los estudios. La detección de la molécula CD31 se evaluó en el pase 1. Los gráficos se obtuvieron con el programa de análisis de datos de citometría Flowjo X. (B) Se observa la expresión de la CD31 conjugada con fluoresceína (FITC) en células endoteliales de vena de cordón umbilical humano. Los núcleos se detectaron con yoduro de propidio color rojo). Las fotografías se adquirieron con una ampliación de 20X.
Figura 2.
Figura 2.. Viabilidad de las células endoteliales por citometría de flujo. El peróxido de hidrógeno (H2 O2 ) disminuye la viabilidad celular, sin embargo, la producción de ERO se evaluó únicamente en las células negativas para yoduro de propidio. (A) No se observó efecto del suero de los diferentes grupos de mujeres incluidas en el estudio sobre la viabilidad celular como se observa en las imágenes representativas. (B) Los resultados se obtuvieron de cinco experimentos independientes. Los datos se indican como la media ± la desviación estándar.
Figura 3.
Figura 3.. Producción de especies reactivas del oxígeno intracelulares por citometría de flujo. (A) Se observó un incremento de la intensidad mediana de fluorescencia del diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA) en las células tratadas con peróxido de hidrógeno. (B) Imagen representativa del efecto inducido por el suero del grupo de mujeres con morbilidad gestacional, trombosis venosa y anticuerpos antifosfolípidos en el incremento de las especies reactivas del oxígeno intracelulares. (C) Comparación entre los grupos de estudio. Se utilizaron un ANOVA de una vía y un ‘post-test’ de Holm-Sidak (p<0,05) *. Los resultados se obtuvieron de cinco experimentos independientes. Los datos se indican como la media ± la desviación estándar.
Figura 4.
Figura 4.. Producción de anión superóxido mitocondrial por citometría de flujo. (A) Se observó un incremento en la intensidad mediana de fluorescencia del MitoSOX en las células tratadas con peróxido de hidrógeno (B y C). Imágenes representativas del efecto de los sueros de los grupos de morbilidad gestacional, trombosis venosa y anticuerpos antifosfolípidos y los de trombosis venosa y anticuerpos antifosfolípidos en el incremento del anión superóxido. (D) Comparación entre los grupos de estudio. Se realizó un ANOVA de una vía y un ‘post-test’ de HolmSidak (p<0,05) y (p<0,001) ***. Los resultados se obtuvieron de cinco experimentos independientes. Los datos se indican como la media ± la desviación estándar.
Figura 5.
Figura 5.. Lipoperoxidación endotelial por citometría de flujo. (A) Imágenes representativas del efecto de los diferentes sueros de las pacientes del estudio en la lipoperoxidación endotelial. (B) Comparación entre los grupos de estudio. Se hizo un análisis ANOVA de una vía y un ‘post-test’ de Holm-Sidak. Los resultados se obtuvieron de cuatro experimentos independientes. No se observaron diferencias en la lipoperoxidación de la membrana de las células endoteliales. Los datos se indican como la media ± la desviación estándar.
Figura 6.
Figura 6.. Actividad basal de la enzima PON1 en los sueros de los grupos de estudio. (A) Curva estándar del ensayo. (B) Comparación de la actividad basal de la PON1 entre los diferentes grupos de estudio con relación al grupo de control. Se hizo un ensayo por duplicado. Se hicieron un análisis de Kruskal-Wallis y un ‘post-test’ de Dunns.
Figura 7.
Figura 7.. Porcentaje de capacidad antioxidante total (%CAT) de los sueros de los grupos de estudio. (A) Porcentaje de capacidad antioxidante total del control negativo con el reactivo DPPH y del control positivo con vitamina C. (B) Evaluación del porcentaje de capacidad antioxidante total de los diferentes grupos de estudio en comparación con el grupo de control. Se hicieron tres ensayos independientes. Para comparar los grupos de estudio, se realizaron un análisis de Kruskal-Wallis y un ‘post-test’ de Dunns; para los controles del ensayo, se utilizó la prueba t de Student (p<0,001)***.
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References

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