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. 2021:28:82.
doi: 10.1051/parasite/2021078. Epub 2021 Dec 15.

Point of care colourimetric and lateral flow LAMP assay for the detection of Haemonchus contortus in ruminant faecal samples

Rojesh Khangembam  1 , Mariann Tóth  2 , Nóra Vass  3 , Marián Várady  4 , Levente Czeglédi  3 , Róbert Farkas  5 , Alistair Antonopoulos  6
Affiliations

Point of care colourimetric and lateral flow LAMP assay for the detection of Haemonchus contortus in ruminant faecal samples

Rojesh Khangembam et al. Parasite. 2021.

Abstract
in English, French

In this study, we present an optimised colourimetric and a lateral flow LAMP assay for the detection of Haemonchus contortus in small ruminant faecal samples. Using a previously published LAMP primer set, we made use of commercially available colourimetric LAMP and lateral flow kits and combined this into an optimised diagnostic assay which was then tested on field faecal samples from Eastern and South-Eastern Hungary as well as a pure H. contortus egg faecal sample from Košice, Slovakia. Both assays showed no conflicts in visual detection of the results. Additionally, we modified and tested several centrifuge-free DNA extraction methods and one bead-beating egg lysis DNA extraction method to develop a true point of care protocol, as the source of the starting DNA is the main rate-limiting step in farm-level molecular diagnosis. Out of the various methods trialed, promising results were obtained with the magnetic bead extraction method. Sample solutions from the Fill-FLOTAC® technique were also utilised, which demonstrated that it could be efficiently adapted for field-level egg concentration to extract DNA. This proof of concept study showed that isothermal amplification technologies with a colourimetric detection or when combined with a lateral flow assay could be an important step for a true point of care molecular diagnostic assay for H. contortus.

Title: Dosage LAMP colorimétrique et à flux latéral pour la détection au point d’intervention d’Haemonchus contortus dans les échantillons de selles de ruminants.

Abstract: Dans cette étude, nous présentons un test colorimétrique optimisé et un test LAMP à flux latéral pour la détection d’Haemonchus contortus dans des échantillons de selles de petits ruminants. À l’aide d’un ensemble d’amorces LAMP publié précédemment, nous avons utilisé des kits colorimétriques LAMP à flux latéral disponibles dans le commerce et les avons combinés dans un test de diagnostic optimisé qui a ensuite été testé sur des échantillons de matières fécales de terrain provenant de l’est et du sud-est de la Hongrie ainsi que d’un échantillon d’œufs de H. contortus provenant de selles de Košice, Slovaquie. Les deux tests n’ont montré aucun conflit dans la détection visuelle des résultats. De plus, nous avons modifié et testé plusieurs méthodes d’extraction d’ADN sans centrifugation et une méthode d’extraction de l’ADN des œufs par lyse par billes pour développer un véritable protocole de point d’intervention, car la source d’ADN de départ est la principale étape limitante du diagnostic moléculaire au niveau de la ferme. Parmi les différentes méthodes testées, des résultats prometteurs ont été obtenus avec la méthode d’extraction par billes magnétiques. Des solutions d’échantillons de la technique Fill-FLOTAC® ont également été utilisées, ce qui a démontré qu’elle pouvait être efficacement adaptée à la concentration d’œufs sur le terrain pour extraire l’ADN. Cette étude de preuve de concept a montré que les technologies d’amplification isotherme avec une détection colorimétrique ou lorsqu’elles sont combinées avec un test de flux latéral pourraient être une étape importante pour un véritable test de diagnostic moléculaire au point d’intervention pour H. contortus.

Keywords: Fill-FLOTAC®; Haemonchus contortus; LAMP assay; Lateral flow; Point-of-Care Diagnosis.

PubMed Disclaimer

Figures

Fig. 1
Fig. 1
Steps for the crude DNA extractions trials based on Chelex® reagent.
Fig. 2
Fig. 2
Sensitivity of the colourimetric LAMP assay as expressed through a 10-fold serial dilution of positive control gDNA of H. contortus. NTC: Non-template control.
Fig. 3
Fig. 3
Validation of the colourimetric LAMP assay by the ITS2 PCR. A: Gel-electrophoresis image of PCR amplicons. Ladder used: 100 bp ladder. B: Corresponding LAMP results. P: Positive control. N: Non-template control. I-X: Farm I-X. DF: Farm DF. GF: Farm GF. Yellow/Orange = Positive/Weak Positive, Pink/Purple = Negative.
Fig. 4
Fig. 4
LF-LAMP assay. Optimised assay tested against three random farm samples. A: LAMP assay using tagged primers. Yellow/Orange = Positive/Weak Positive, Pink/Purple = Negative. B: LF-LAMP assay using the tagged LAMP amplicons. Positive detection of H. contortus presents as a band in both Control and Test lines. Negative detection presents as a band in only the Control line. Failed assay presents as no bands on LF strip. 1: Farm V. 2: Farm VIII. 3: Farm X. NTC: Non-template control. PC: Positive control gDNA of H. contortus.
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