Skip to main page content
U.S. flag

An official website of the United States government

Dot gov

The .gov means it’s official.
Federal government websites often end in .gov or .mil. Before sharing sensitive information, make sure you’re on a federal government site.

Https

The site is secure.
The https:// ensures that you are connecting to the official website and that any information you provide is encrypted and transmitted securely.

Access keys NCBI Homepage MyNCBI Homepage Main Content Main Navigation
. 2022 Jan-Mar;39(1):15-23.
doi: 10.17843/rpmesp.2022.391.9292. Epub 2022 Jun 24.

Cloning, expression and seroreactivity of the recombinant lipopolysaccharide assembly protein - D (LptD) from Bartonella bacilliformis

[Article in Spanish, English]
Astrid Flores-Nuñez  1   2 , Gladis Ventura  1 , Henri Bailon  1 , Adolfo Marcelo  3 , Gustavo Sandoval  2 , Carlos Padilla-Rojas  1
Affiliations

Cloning, expression and seroreactivity of the recombinant lipopolysaccharide assembly protein - D (LptD) from Bartonella bacilliformis

[Article in Spanish, English]
Astrid Flores-Nuñez et al. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2022 Jan-Mar.

Abstract
in English, Spanish, Spanish

Objective.: To evaluate in silico and at the serological level the antigenic potential of the recombinant extracellular domain of the lipopolysaccharide assembly protein - D (LptD) of Bartonella bacilliformis (dexr_LptD).

Materials and methods.: Through in silico analysis, we selected a B. bacilliformis protein with antigenic and immunogenic potential. The selected protein gene was cloned into Escherichia coli TOP10 and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Recombinant protein was expressed using isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) and induction conditions were optimized. Finally, it was purified with Ni-IDA resin (His60 Ni Superflow) and a Western Blot assay was conducted.

Results.: In silico, the selected protein was LptD because it is located in the outer membrane and is antigenic and immunogenic. Optimized conditions for dexr_LptD induction were 0.5 mM IPTG, 16 hours, TB (Terrific Broth) medium, 3% (v/v) ethanol, 28 ºC, OD600: 1-1.5 and 200 rpm. Purification was carried out under denaturating conditions on a small scale and we obtained 2.6 μg/mL of partially purified dexr_LptD. The Western Blot assay showed a positive reaction between the sera from patients with Carrión's Disease and dexr_LptD, which shows the antigenicity of dexr_LptD.

Conclusions.: The dexr_LptD shows antigenicity both in silico and at the serological level, these results are the basis for further studies on vaccine candidates against Carrion's Disease.

Objetivo.: Evaluar in silico y a nivel serológico el potencial antigénico del dominio extracelular recombinante de la proteína de ensamblaje de lipopolisacáridos - D (LptD) de Bartonella bacilliformis (dexr_LptD).

Materiales y métodos.: Mediante el análisis in silico se realizó la selección de una proteína de B. bacilliformis con potencial antigénico e inmunogénico. El gen de la proteína seleccionada se clonó en Escherichia coli TOP10 y se expresó en Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. La proteína recombinante fue expresada usando isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y se optimizaron las condiciones de inducción. Por último, se purificó con resina Ni-IDA (His60 Ni Superflow) y se realizó un ensayo de Western Blot.

Resultados.: In silico, la proteína seleccionada fue LptD por estar localizada en la membrana externa y ser antigénica e inmunogénica. Las condiciones optimizadas para la inducción del dexr_LptD fueron 0,5 mM IPTG, 16 h, medio TB (Terrific Broth), etanol al 3% (v/v), 28 ºC, OD600: 1-1,5 y 200 r.p.m. La purificación se realizó en condiciones denaturantes a pequeña escala y se obtuvo 2,6 µg/mL de dexr_LptD parcialmente purificada. El ensayo de Western Blot mostró una reacción positiva entre los sueros provenientes de pacientes con la enfermedad de Carrión y dexr_LptD, ello evidencia la antigenicidad del dexr_LptD.

Conclusiones.: El dexr_LptD muestra antigenicidad in silico y a nivel serológico, estos resultados son base para posteriores estudios sobre candidatos vacunales contra la enfermedad de Carrión.

Objetivo.: Evaluar in silico y a nivel serológico el potencial antigénico del dominio extracelular recombinante de la proteína de ensamblaje de lipopolisacáridos - D (LptD) de Bartonella bacilliformis (dexr_LptD).

Materiales y métodos.: Mediante el análisis in silico se realizó la selección de una proteína de B. bacilliformis con potencial antigénico e inmunogénico. El gen de la proteína seleccionada se clonó en Escherichia coli TOP10 y se expresó en Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. La proteína recombinante fue expresada usando isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y se optimizaron las condiciones de inducción. Por último, se purificó con resina Ni-IDA (His60 Ni Superflow) y se realizó un ensayo de Western Blot.

Resultados.: In silico, la proteína seleccionada fue LptD por estar localizada en la membrana externa y ser antigénica e inmunogénica. Las condiciones optimizadas para la inducción del dexr_LptD fueron 0,5 mM IPTG, 16 h, medio TB (Terrific Broth), etanol al 3% (v/v), 28 ºC, OD600: 1-1,5 y 200 r.p.m. La purificación se realizó en condiciones denaturantes a pequeña escala y se obtuvo 2,6 µg/mL de dexr_LptD parcialmente purificada. El ensayo de Western Blot mostró una reacción positiva entre los sueros provenientes de pacientes con la enfermedad de Carrión y dexr_LptD, ello evidencia la antigenicidad del dexr_LptD.

Conclusiones.: El dexr_LptD muestra antigenicidad in silico y a nivel serológico, estos resultados son base para posteriores estudios sobre candidatos vacunales contra la enfermedad de Carrión.

PubMed Disclaimer

Conflict of interest statement

Conflicts of interest: The authors declare that they have no conflicts of interest.

Figures

Figure 1
Figure 1. Study flowchart. In silico analysis: shows the bioinformatics programs and criteria for the selection of the studiedprotein. Experimental assays: sequence of procedures performed to obtain and evaluate the recombinant extracellular domain of the Bartonella bacilliformis lipopolysaccharide assembly protein - D (dexr_LptD). LptD (lipopolysaccharide assembly protein - D), HLA-I and HLA-II (human leukocyte antigens I and II), IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside). Bioinformatics programs: SignalP4, VaxiJen v2.0 and Vaxign, ProtParam/ Raptor X Structure Prediction/ Ramachandran plot, Ellipro, Toxin Pred, NetMHCpan 4.0 Server and NetMHCII 2.3 Server, IEDB Server, PrimerSelect 4.05 and OligoAnalyzer 3.1.
Figure 2
Figure 2. 3D model of the recombinant extracellular lipopolysaccharide assembly domain - D of Bartonella bacilliformis (dexr_LptD). A: lateral view, B: top view. Secondary structures: beta sheets (yellow), alpha helix (red), loops (green) and histidine tail (white).
Figure 3
Figure 3. Expression optimization process of the recombinant extracellular lipopolysaccharide assembly domain - D of Bartonella bacilliformis (dexr_LptD), where M (marker: Unstained Protein Standards) and arrows indicate the height of the dexr_LptD (67.42 kDa) (induced band).
Figure 4
Figure 4. Partial purification of the recombinant extracellular domain of the lipopolysaccharide assembly protein - D of Bartonella bacilliformis (dexr_LptD) under denaturing and non-denaturing conditions. M: Marker: Unstained Protein Standards. D: partial purification under denaturing conditions. ND: partial purification under non-denaturing conditions. Arrows indicate the height of dexr_LptD (67.42 kDa).
Figure 5
Figure 5. Western Blot. M: Marker: Prestained Natural SDS-PAGE Protein Standards. Left side: PAGE-SDS gel. A: 115 ng of the recombinant extracellular domain of the partially purified Bartonella bacilliformis lipopolysaccharide assembly protein - D (dexr_LptD) (indicated by arrow). Right side: nitrocellulose membrane. B: positive Western blot reaction between dexr_LptD and sera from patients with Carrion’s disease (indicated by arrow).
Figura 1
Figura 1. Flujograma de trabajo. Análisis in silico: muestra los programas bioinformáticos y criterios para la selección de la proteína en estudio. Ensayos experimentales: secuencia de procedimientos realizados para la obtención y evaluación dominio extracelular recombinante de la proteína de ensamblaje de lipopolisacáridos - D de Bartonella bacilliformis (dexr_LptD). LptD (proteína de ensamblaje de lipopolisacáridos - D), HLA-I y HLA-II (antígenos leucocitarios humanos I y II), IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranósido). Programas bioinformáticos: SignalP4., VaxiJen v2.0 y Vaxign, ProtParam/ Raptor X Structure Prediction/ plot de Ramachandran, Ellipro, Toxin Pred, NetMHCpan 4.0 Server y NetMHCII 2.3 Server, Servidor IEDB, PrimerSelect 4.05 y OligoAnalyzer 3.1.
Figura 2
Figura 2. Modelo 3D del dominio extracelular recombinante de ensamblaje de lipopolisacáridos - D de Bartonella bacilliformis (dexr_LptD). A: vista lateral, B: vista superior. Estructuras secundarias: láminas beta (de color amarillo), hélice alfa (de color rojo), loops (de color verde) y la cola de histidina (de color blanco).
Figura 3
Figura 3. Proceso de optimización de la expresión del dominio extracelular recombinante de ensamblaje de lipopolisacáridos - D de Bartonella bacilliformis (dexr_LptD), donde M (marcador: Unstained Protein Standards) y las flechas indican la altura del dexr_LptD (67,42 kDa) (banda inducida).
Figura 4
Figura 4. Purificación parcial del dominio extracelular recombinante de la proteína de ensamblaje de lipopolisacáridos - D de Bartonella bacilliformis (dexr_LptD) en condiciones denaturantes y no denaturantes. M: Marcador: Unstained Protein Standards. D: purifación parcial bajo condiciones denaturantes. ND: purificación parcial bajo condiciones no denaturantes. Las flechas indican la altura del dexr_LptD (67,42 kDa).
Figura 5
Figura 5. Western Blot. M: Marcador: Prestained Natural SDS-PAGE Protein Standards. Lado izquierdo: Gel de PAGE-SDS. A: 115 ng del dominio extracelular recombinante de la proteína de ensamblaje de lipopolisacáridos - D de Bartonella bacilliformis (dexr_LptD) parcialmente purificada (indicado con la flecha). Lado derecho: membrana de nitrocelulosa. B: reacción positiva del Western Blot realizado entre dexr_LptD y sueros de pacientes que padecieron la enfermedad de Carrión (indicado con la flecha).
See this image and copyright information in PMC

References

    1. . Minnick MF, Anderson BE, Lima A, Battisti JM, Lawyer PG, Birtles RJ. Oroya fever and verruga peruana: bartonellosis unique to South America. PLoS Negl Trop Dis. 2014; 8(7): e2919. doi: 10.1371/journal.pntd.0002919. - PMC - PubMed
    2. Minnick MF, Anderson BE, Lima A, Battisti JM, Lawyer PG, Birtles RJ. Oroya fever and verruga peruana bartonellosis unique to South America. PLoS Negl Trop Dis. 2014;8(7):e2919. doi: 10.1371/journal.pntd.0002919. - DOI - PMC - PubMed
    1. Del Valle J, Silva W, Tinco C, Pons M, Del Valle L, Casabona V. Diagnosis of Carrion's disease by direct blood PCR in thin blood smear negative samples. PLoS One. 2014;9(3):e92283. doi: 10.1371/journal.pone.0092283. - DOI - PMC - PubMed
    1. Schlüfter E, Ventosilla P, Schultze TG, Ballhorn W, Tsukayama P, Kempf VA. Identification of immunodominant Bartonella bacilliformis proteins a combined in-silico and serology approach. The Lancet Microbe. 2021;2(12):e685–e694. doi: 10.1016/S2666-5247(21)00184-1. - DOI - PubMed
    1. Gomes C, Pons M, del Valle-Mendoza J, Matsuoka M, Ruiz J. Immunogenic peptides from Pap31 and SCS-a of Bartonella bacilliformis One step closer to a rapid diagnostic tool for Carrion's disease. Pathogens. 2021;10(8):917–917. doi: 10.3390/pathogens10080917. - DOI - PMC - PubMed
    1. Padilla C, Gallegos K, Marcelo A, Chenet S, Baldeviano C. Expresión y serorreactividad de la lipoproteína recombinante de 43-kda de Bartonella bacilliformis. Rev Peru Med Exp Salud Pública. 2006;23(3):182–187. doi: 10.17843/rpmesp.2006.233.1047. - DOI

MeSH terms

LinkOut - more resources