Clinical validation of the isothermal RT-LAMP test for rapid diagnosis of SARS-CoV-2

Abstract

Introducción. Desde el primer reporte en la provincia de Wuhan (China) en el año 2019, el SARS-CoV-2 se ha diseminado por todo el mundo, provocando un enorme impacto en la salud pública. Para su diagnóstico, la Organización Mundial de la Salud ha incentivado el desarrollo de pruebas rápidas, de simple ejecución, sensibles y específicas, que complementan la RT-qPCR como prueba de referencia. La prueba RT-LAMP ha mostrado ser una excelente alternativa para la detección del SARS-CoV-2 en diferentes biofluidos.

Objetivo: Validar la técnica RT-LAMP colorimétrica en muestras de hisopado nasofaríngeo previamente confirmadas por RT-qPCR, usando el protocolo Charité, Berlín, Alemania. Materiales y métodos. Un total de 153 muestras de hisopado nasofaríngeo de individuos con sospecha de COVID-19 se sometieron a RT-qPCR y RT-LAMP, usando un estuche comercial colorimétrico (NEB, Germany). La RT-LAMP se practicó con las muestras de ARN extraídas del hisopado nasofaríngeo y con muestras crudas sin previa extracción de ARN. El resultado fue evaluado por un simple cambio de color en la reacción.

Resultados: La sensibilidad y especificidad de la técnica RT-LAMP para detectar el gen N del SARS-CoV-2 mediante un set de cebadores previamente reportados (set de Broughton), arrojó valores de 0,97 (0,85-1,00) y 0,81 (0,65-0,92), respectivamente, con un intervalo de confianza del 95%. Otro set de cebadores dirigidos contra otra región del mismo gen (set de Lalli) arrojó valores de sensibilidad y especificidad de 0,96 (0,78-1,00) y 0,77 (0,55-0,92), respectivamente. Sin previa extracción de ARN, se encontró que la sensibilidad fue del 0,95 (0,74-1,00) y la especificidad del 0,88 (0,64-0,99).

Conclusiones: Estos resultados evidencian que la técnica RT-LAMP podría considerarse una prueba diagnóstica rápida, de fácil ejecución, libre de equipos sofisticados, sensible y específica, para el diagnóstico del SARS-CoV-2 en muestras de hisopados nasofaríngeos.

Keywords: COVID-19/diagnosis; molecular diagnostic techniques; sensitivity and specificity; point-of-care testing COVID-19/diagnóstico.

Figura 1. Flujograma conceptual de la prueba LAMP para detectar SARS-CoV-2 en muestras de hisopado nasal. A) La reacción de RT-LAMP a partir de muestras de hisopado nasofaríngeo de individuos con sospecha de Covid-19 se ejecuta a partir de: i) ARN extraído o ii) directamente de las muestras sin extracción de ARN, con un previo paso de inactivación a 95 °C por 5 minutos. B) La RT-LAMP hace uso de 6 cebadores (marcados aquí en colores) que, en presencia del ARN diana (espiral de color rojo), inician la amplificación isotérmica, generando protones que inducen un cambio de pH en la reacción, con la subsecuente virada de color de rosa a amarillo. C) La reacción de amplificación en RT-LAMP genera productos de diferentes masas moleculares en forma de concatámeros que pueden observarse fácilmente en un gel de agarosa.

Figura 2. Resultado colorimétrico de RT-LAMP. Reacción color rosa: muestra negativa para SARS-CoV-2. Reacción color amarillo: resultado positivo para el gen N del SARS-CoV-2

Figura 3. Localización de los sets de cebadores en el gen N del SARS-CoV-2. F3: cebador sentido, B3: cebador inverso o antisentido; FIP: cebador sentido interno; BIP: cebador inverso interno; LF: cebador lazo sentido; LB: cebador lazo inverso

Figura 4. Detección colorimétrica de SARS-CoV-2 por RT-LAMP; empleando dos sets de cebadores, Broughton (A) y Lalli (B). Se recolectaron 117 muestras de ARN purificado a partir de hisopado nasofaríngeo de individuos sintomáticos para COVID-19. La reacción fue ejecutada a una temperatura de 65 °C durante 30 minutos, usando el estuche comercial Warmstart colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA & RNA) (NEB) en 20 μΙ de volumen final. La reacción de RT-LAMP tenía como diana el gen N del SARS-CoV-2. Las muestras negativas para SARS-CoV-2 se muestran en color rosa y las muestras positivas se visualizan por un cambio de color de rosa a amarillo. Los amplicones producto de la reacción de amplificación fueron separados en un gel de agarosa al 2 % y teñidos con SYBR Safe (Invitrogen). El patrón de tipo escalera observado en las muestras positivas, es coherente con una amplificación positiva y el subsecuente viraje de color en las muestras con presencia del SARS-CoV-2, en tanto que los productos de amplificación están ausentes en las muestras negativas. CP: fragmento sintético del gen N del SASR-CoV-2. CN: reacciones incubadas con agua de grado para biología molecular en lugar de ARN.

Figura 5. Detección colorimétrica de SARS-CoV-2 por RT-LAMP en muestras de hisopado nasofaríngeo, sin previa extracción de ARN. Se precalentaron 36 muestras de hisopado nasofaríngeo durante 5 minutos a 95 °C; posteriormente, se agregaron 3 μl de muestra a la reacción RT-LAMP usando el estuche comercial Warmstart colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA & RNA) (NEB) en 20 μl de volumen final. La RT-LAMP tenía como diana el gen N del SASR-CoV-2. Las muestras negativas para este virus se muestran en color rosa y las muestras positivas se visualizan por un cambio de color de rosa a amarillo. Los amplicones producto de la reacción de amplificación fueron resueltos en un gel de agarosa al 2 % y teñidos con SYBR Safe (Invitrogen). Se muestra el patrón típico de amplificación de la técnica RT- LAMP en muestras positivas y el cambio de color en la reacción; en muestras negativas, la mezcla reactiva permanece de color rosa y no se observan bandas en el gel electroforético. CP: fragmento sintético del gen N del SASR-CoV-2. CN: reacciones incubadas con agua de grado para biología molecular en lugar de muestras de hisopado.

Figura 6. Curva de calibración número de copias gen E del SARS-CoV-2. Se confirmó el número de copias encontrado a partir de la fórmula: Número de copias (moléculas) = (Xng * 6.0221 * 10²³ moléculas/mol) ^ ((N *660 g/mol) * 1 * 10 ⁹ng/g) Donde, X = concentración del amplicón (ng); N = longitud del amplicón dsDNA 660 g/mol = masa media de 1 pb de dsDNA