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. 2025 Apr;59(2):169-177.
doi: 10.1177/00236772241262119. Epub 2024 Oct 4.

Mouse aversion to induction with isoflurane using the drop method

Maya J Bodnar  1 , I Joanna Makowska, Courtney T Boyd  1 , Catherine A Schuppli, Daniel M Weary  1
Affiliations

Mouse aversion to induction with isoflurane using the drop method

Maya J Bodnar et al. Lab Anim. 2025 Apr.

Abstract
in English, French, German, Spanish

Isoflurane anesthesia prior to carbon dioxide euthanasia is recognized as a refinement by many guidelines. Facilities lacking access to a vaporizer can use the "drop" method, whereby liquid anesthetic is introduced into an induction chamber. Knowing the least aversive concentration of isoflurane is critical. Previous work has demonstrated that isoflurane administered with the drop method at a concentration of 5% is aversive to mice. Other work has shown that lower concentrations (1.7% to 3.7%) of isoflurane can be used to anesthetize mice with the drop method, but aversion to these concentrations has not been tested. We assessed aversion to these lower isoflurane concentrations administered with the drop method, using a conditioned place aversion (CPA) paradigm. Female C57BL/6J (OT-1) mice (n = 28) were randomly allocated to one of three isoflurane concentrations: 1.7%, 2.7%, and 3.7%. Mice were acclimated to a light-dark apparatus. Prior to and following dark (+ isoflurane) and light chamber conditioning sessions, mice underwent an initial and final preference assessment; the change in the duration spent within the dark chamber between the initial and final preference tests was used to calculate a CPA score. Aversion increased with increasing isoflurane concentration: from 1.7% to 2.7% to 3.7% isoflurane, mean ± SE CPA score decreased from 19.6 ± 20.1 s to -25.6 ± 23.2 s, to -116.9 ± 30.6 s (F1,54 = 15.4, p < 0.001). Our results suggest that, when using the drop method to administer isoflurane, concentrations between 1.7% and 2.7% can be used to minimize female mouse aversion to induction.

L’anesthésie à l’isoflurane avant l’euthanasie au dioxyde de carbone (CO2) est reconnue comme un raffinement par de nombreuses directives. Les installations qui n’ont pas accès à un vaporisateur peuvent utiliser la méthode « par goutte », par laquelle un anesthésique liquide est introduit dans une chambre d’induction. Il est essentiel de connaître la concentration la moins aversive d’isoflurane. Des travaux antérieurs ont démontré que l’isoflurane administré avec la méthode par goutte à une concentration de 5% était aversif pour les souris. D’autres travaux ont montré que des concentrations plus faibles (1,7–3,7%) d’isoflurane pouvaient être utilisées pour anesthésier des souris avec la méthode par goutte, mais l’aversion pour ces concentrations n’a pas été testée. Nous avons évalué l’aversion à ces concentrations plus faibles d’isoflurane administrées avec la méthode par goutte en utilisant un paradigme d’aversion du lieu conditionné (CPA). Des souris femelles C57BL/6J (OT-1) (n = 28) ont été affectées au hasard à l’une des trois concentrations d’isoflurane suivantes: 1,7%, 2,7% et 3,7%. Les souris ont été acclimatées à un appareil lumière-obscurité. Avant et après les séances de conditionnement en chambre obscure (+ isoflurane) et en chambre lumineuse, les souris ont subi une évaluation initiale et finale des préférences; le changement de la durée passée dans la chambre obscure entre les tests initiaux et finaux des préférences a été utilisé pour calculer un score CPA. L’aversion augmentait avec l’augmentation de la concentration d’isoflurane; de 1,7% à 2,7% à 3,7% d’isoflurane, le score CPA moyen ± ET diminuait de 19,6 ± 20,1 s à −25,6 ± 23,2 s, à −116,9 ± 30,6 s; F1,54 = 15,4, p < 0,001. Nos résultats suggèrent que, lors de l’utilisation de la méthode par goutte pour administrer de l’isoflurane, des concentrations comprises entre 1,7 et 2,7% peuvent être utilisées pour minimiser l’aversion des souris femelles à l’induction.

Die Anästhesie mit Isofluran vor der Tötung mit Kohlendioxid (CO2) gilt in vielen Leitlinien als Verbesserung. Einrichtungen, die keinen Zugang zu einem Verdampfer haben, können die Tropfenmethode anwenden, bei der ein flüssiges Anästhetikum in eine Induktionskammer gegeben wird. Es kommt dabei wesentlich darauf an, die am wenigsten aversive Isofluran-Konzentration zu kennen. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Isofluran, das mit der Tropfenmethode in einer Konzentration von 5% verabreicht wird, für Mäuse aversiv ist. Andere Untersuchungen ergaben, dass niedrigere Isofluran-Konzentrationen (1,7–3,7%) zur Betäubung von Mäusen mit der Tropfenmethode verwendet werden können, allerdings wurde die Aversion gegen diese Konzentrationen nicht getestet. Wir untersuchten die Aversion gegenüber diesen niedrigeren Isofluran-Konzentrationen, die mit der Tropfenmethode verabreicht wurden, mit einem Paradigma der konditionierten Ortsaversion (CPA). Weibliche C57BL/6J (OT-1)-Mäuse (n = 28) wurden nach dem Zufallsprinzip einer von drei Isofluran-Konzentrationen zugewiesen: 1,7%, 2,7% und 3,7%. Die Mäuse wurden an einen Hell-Dunkel-Mechanismus akklimatisiert. Vor und nach den Konditionierungsphasen in der dunklen (+ Isofluran) und der hellen Kammer wurden die Mäuse jeweils einer anfänglichen und abschließenden Präferenzbewertung unterzogen; die Veränderung der in der dunklen Kammer verbrachten Zeit zwischen den anfänglichen und abschließenden Präferenztests wurde zur Berechnung eines CPA-Scores verwendet. Die Aversion nahm mit steigender Isofluran-Konzentration zu; von 1,7% über 2,7% bis 3,7% Isofluran sank der mittlere CPA-Wert ± SE von 19,6 ± 20,1 s über −25,6 ± 23,2 s auf −116,9 ± 30,6 s; F1,54 = 15,4, p < 0,001. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass bei Verwendung der Tropfenmethode zur Verabreichung von Isofluran Konzentrationen zwischen 1,7 und 2,7% verwendet werden können, um die Aversion weiblicher Mäuse gegen die Induktion zu minimieren.

La anestesia con isoflurano previa a la eutanasia con dióxido de carbono (CO2) está reconocida como un refinamiento por muchas directrices. Los centros que no tengan acceso a un vaporizador pueden utilizar el método de la “gota”, por el que se introduce anestésico líquido en una cámara de inducción. Conocer la concentración menos aversiva de isoflurano es primordial. Trabajos anteriores demostraron que el isoflurano administrado con el método de la gota a una concentración del 5% es aversivo para los ratones. Otros estudios han demostrado que pueden utilizarse concentraciones más bajas (1,7–3,7%) de isoflurano para anestesiar ratones con el método de la gota pero no se ha comprobado la aversión a estas concentraciones. Evaluamos la aversión a estas concentraciones más bajas de isoflurano administradas con el método de la gota, utilizando un paradigma de aversión condicionada al lugar (CPA). Los ratones hembra C57BL/6J (OT-1) (n = 28) fueron asignados aleatoriamente a una de las tres concentraciones de isoflurano: 1,7%, 2,7%, y 3,7%. Los ratones fueron aclimatados a un aparato de luz-oscuridad. Antes y después de las sesiones de acondicionamiento en cámara oscura (+ isoflurano) y luminosa, los ratones se sometieron a una evaluación inicial y final de las preferencias; el cambio en la duración de permanencia en la cámara oscura entre las pruebas de preferencia inicial y final se utilizó para calcular una puntuación CPA. La aversión aumentó con el incremento de la concentración de isoflurano; del 1,7% al 2,7% y al 3,7% de isoflurano, la puntuación CPA media ± SE disminuyó de 19,6 ± 20,1 s a −25,6 ± 23,2 s, a −116,9 ± 30,6 s; F1,54 = 15,4, p < 0,001. Nuestros resultados sugieren que, cuando se utiliza el método de la gota para administrar isoflurano, pueden emplearse concentraciones entre el 1,7 y el 2,7% para minimizar la aversión de las hembras de ratón a la inducción.

Keywords: Euthanasia; conditioned place aversion; drop method; isoflurane; mice; refine; welfare.

PubMed Disclaimer

Conflict of interest statement

Declaration of conflicting interestsThe authors declared the following potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article: IJM is employed by the Animal Welfare Institute, which funded MJB’s salary during the conduct of this study. In her role as adjunct professor in the UBC Animal Welfare Program, IJM had limited advisory input on practical aspects of the study design and execution. After this study was completed, MJB began graduate work on a different thesis topic with IJM as co-supervisor. In her role as M.Sc. co-supervisor, IJM also assumed a supervisory role of MJB’s non-thesis research, and provided input on the data analysis, interpretation, and drafting of this manuscript.

Figures

Figure 1.
Figure 1.
Illustration of our experimental CPA apparatus consisting of three connected chambers: dark, middle, and light (from left to right in the illustration) with distinct somatosensory cues. Guillotine doors are located along either side of the middle chamber, separating this chamber from the dark and light chambers. Two holes on the lid of the dark chamber are for a scavenging hose and to flush the chamber with oxygen between trials. The oxygen tubing was sealed during trials. The cotton pad and plastic mesh are located directly below the attached oxygen tubing. The clamped oxygen tubing was placed in the hole following the administration of isoflurane (Baxter Corporation, Mississauga, Canada) onto the cotton pad via a syringe.
Figure 2.
Figure 2.
CPA score (s) declined with increasing concentration of isoflurane (p < 0.001). Black bars show treatment means, and individual points show the values for each mouse (ns = 10, 9, and 9 for the 1.7%, 2.7%, and 3.7% treatments, respectively). Points are jittered horizontally to better visualize overlapping points.
Figure 3.
Figure 3.
Changes in latency to enter the dark (+ isoflurane) chamber across conditioning sessions. Each plot represents an individual mouse (ns = 10, 9, and 9 mice in the 1.7%, 2.7%, and 3.7% treatments). The maximum possible latency to enter the dark (+ isoflurane) chamber was 45 s.
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References

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    1. Canadian Council on Animal Care. CCAC revised guidance on euthanasia using carbon dioxide, https://ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/CCAC_Revised_Guidance_on_... (2020, accessed 8 August 2023).
    1. European Parliament. Directive 2010/63/EU, http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033... (2010, accessed 18 August 2023).

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