Standardization of the use of opsonized zymosan as stimulus in the 1,2,3-dihydrorhodamine technique for the assessment of neutrophil respiratory burst

Abstract

Introduction: Chronic granulomatous disease is a defect in phagocytosis due to deficiency of gp91phox, p22phox, p47phox, p40phox, and p67phox (classic form of the disease). Recently, EROS and p40phox deficiency were described as responsible for the non-classical form of the disease. The 1,2,3-dihydrorhodamine oxidation technique, with phorbol-12-myristate-13-acetate as a stimulus, is performed to diagnose the classic chronic granulomatous disease. However, oxidation mediated by EROS and p40phox requires stimuli such as zymosan, Escherichia coli, or Staphylococcus aureus.

Objective: To optimize the 1,2,3-dihydrorhodamine technique using zymosan to assess neutrophil respiratory burst and detect the non-classical chronic granulomatous disease.

Materials and method: Blood was obtained from five healthy subjects after the signature of the informed consent. The 1,2,3-dihydrorhodamine technique was performed with phorbol-12-myristate-13-acetate as control and different quantities of opsonized zymosan (150, 100, 50, 20, and 10 μg). We obtained through flow cytometry the mean fluorescence intensity of rhodamine 1,2,3 oxidated in the neutrophil population and calculated the oxidation index. The Kolmogorov-Smirnov test, ANOVA, and Tukey’s post-hoc analysis were used. We considered a p value ≤ 0.05 as statistically significant.

Results: The phorbol-12-myristate-13-acetate increased the rhodamine 1,2,3 mean fluorescence intensity in healthy subjects. Among the different zymosan conditions tested, we selected 50 μg as the optimal and reproducible amount in all controls according to the statistical analysis and cytometric findings.

Conclusions: We present the optimization of the 1,2,3-dihydrorhodamine technique using zymosan. We propose its implementation in clinical diagnostic laboratories to expand the diagnosis of chronic granulomatous disease.

Keywords: granulomatous disease; chronic; rhodamine 1,2,3; zymosan; NADPH oxidase.

Figura 1.. Flujograma del diagnóstico de la enfermedad granulomatosa crónica con la técnica de 1,2,3-dihidrorrodamina, usando dos estímulos: forbol-12-acetato-13-miristato (PMA) y zimosán. En un sujeto sano hay producción de especies reactivas de oxígeno con PMA y zimosán; en un paciente con enfermedad granulomatosa crónica clásica no hay producción de especies reactivas de oxígeno con los dos estímulos, y en un paciente con la forma no clásica de la enfermedad, la producción de especies reactivas de oxígeno es normal con zimosán, pero nula con PMA. EGC: enfermedadgranulomatosa crónica 123-DHR: 1,2,3-dihidrorrodamina

Figura 2.. Esquema de trabajo de la optimización de la prueba de 1,2,3-dihidrorrodamina con zimosán opsonizado. Las cantidades decrecientes de zimosán se muestran a partir de la condición 4. La condición 3 (PMA) fue el estímulo de referencia. ST: sintinción; PMA: forbol-12-acetato-13-miristato; ZO: zimosán opsonizado; 1,2,3-DHR: 1,2,3-dihidrorrodamina.

Figura 3.. Representación gráfica de la distribución de la intensidad de fluorescencia media de rodamina 1,2,3 como respuesta a diferentes cantidades de zimosán opsonizado. Se observó una disminución gradual de la intensidad de fluorescencia media directamente proporcional a la cantidad de zimosán. El valor de p compara la media de intensidad de fluorescencia de todas las cantidades de zimosán (10, 20, 50, 100 y 150 µg). Entre las cantidades de 10 y 20 µg hay una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,01). La línea vertical entre las figuras geométricas representa la desviación estándar y, la línea horizontal, la intensidad de fluorescencia media.

Figura 4.. Histogramas que muestran neutrófilos estimulados con diferentes cantidades de zimosán opsonizado. La línea gris muestra la condición sin estímulo y la línea negra ilustra la condición con zimosán opsonizado. En el recuadro inferior de cada histograma se muestran las cantidades de zimosán opsonizado: A) 150 µg, B) 100 µg, C) 50 µg, D) 20 µg y E) 10 µg; y la intensidad de fluorescencia media de la rodamina 123. En la figura E, la cantidad de 10 µg no fue suficiente para activar la producción de especies reactivas de oxígeno en el 100 % de los neutrófilos, por lo que se observó un patrón bimodal de rodamina 123. IFM: intensidad de fluorescencia media; ZO: Zimozan opsonizado; ns: no significativo ** p< 0,01;

Figura 5.. Dispersión de neutrófilos en función del tamaño y la granularidad. En las gráficas de puntos, se observan diferentes patrones de dispersión entre la respuesta a PMA (A) y a 50 µg de zimosán opsonizado (B). Los neutrófilos se muestran dentro del recuadro negro FSC: forwardscatter, SSC: side scatter, PMA: forbol-12-miristato-13-acetato

Figura suplementaria 1.. Activación de la NADPH oxidasa como respuesta al forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) como estímulo de referencia. EI histograma de color gris representa la intensidad de la fluorescencia media basal de los neutrófilos con 1,2,3-dihidrorrodamina. EI histograma de color negro representa la señal producida por la estimulación con PMA. Se observa un incremento de la intensidad de fluorescencia media en un orden de magnitud de 10³.