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. 2025 Aug;36(4):474-484.
doi: 10.1111/vde.13345. Epub 2025 Apr 21.

A novel approach for feline sporotrichosis pathogen detection based on loop-mediated isothermal amplification

Steffanie Amadei  1 , Júlia Campos  2   3 , Amanda Bertão-Santos  4 , Alis Frentzel  5 , Hugo Ávila  5 , Fabiana S Monti  2   3 , Marconi R Farias  2   3
Affiliations

A novel approach for feline sporotrichosis pathogen detection based on loop-mediated isothermal amplification

Steffanie Amadei et al. Vet Dermatol. 2025 Aug.

Abstract
in English, German, Chinese, French, Japanese, Portuguese, Spanish

Background: Sporotrichosis is a chronic, mycotic infection caused by fungi of the genus Sporothrix. Zoonotic sporotrichosis occurs mainly through S. brasiliensis transmission, resulting from the organism's traumatic introduction via scratches or bites, or contact with exudate from contaminated cats. The loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay is a viable molecular alternative for detecting Sporothrix in veterinary low-resource settings.

Hypothesis/objectives: To develop a LAMP method for Sporothrix identification using fungal isolates and clinical samples of domestic cats (Felis catus).

Materials and methods: DNA samples were collected from Sporothrix isolates and clinical samples of cats positive for sporotrichosis. Six LAMP primers were designed to amplify the 28S ribosomal RNA region of S. schenckii and S. brasiliensis. Colorimetric assay and agarose gel electrophoresis were used to analyse the LAMP amplification. Isolated samples were sequenced using the Sanger technique, employing the amplification of genetic material by conventional PCR with the external primers of LAMP.

Results: A sensitivity of 96.77% for isolated Sporothrix samples was found using the LAMP method, confirmed by Sanger sequencing. The detection limit of LAMP was between 1 and 10 pg of Sporothrix DNA according to the sample matrix. LAMP showed a sensitivity of 100% using blood samples, 77.78% using intranasal swabs and 92.31% and 100% using swab and adhesive tape samples of cutaneous lesions, respectively.

Conclusions and clinical relevance: These findings support a simple and quick LAMP-based screening tool for detecting Sporothrix in isolated and clinical samples. This accessible test can aid in disease management when standard culture analysis is unavailable or impractical.

Hintergrund: Die Sporotrichose ist eine chronische, mykotische Infektion, die durch den Fungus der Gattung Sporothrix verursacht wird. Eine zoonotische Sporotrichose tritt vor allem durch eine Übertragung von S. brasiliensis auf, resultierend aus einer traumatischen Übertragung des Organismus durch Kratzer oder Bisse, oder dem Kontakt mit Exsudat von kontaminierten Katzen. Die isothermische Nukleinsäure‐Amplifikationstechnik (LAMP) ist eine wertvolle molekulare Alternative zur Bestimmung von Sporothrix in einem Veterinärsetting mit wenig Ressourcen.

Hypothese/ziele: Die Entwicklung einer LAMP‐Methode zur Sporothrix Identifizierung mittels Fungus Isolaten und klinischen Proben von Hauskatzen (Felis catus).

Materialien und methoden: Es wurden DNA‐Proben von Sporothrix Isolaten und von klinischen Proben von Sporotrichose‐positiven Katzen gesammelt. Sechs LAMP‐Primer wurden designed, um die 28S ribosomale RNA‐Region von S. schenkii und S. brasiliensis zu amplifizieren. Ein kolorimetrischer Assay und eine Agarose‐Gelelektrophorese wurden eingesetzt, um die LAMP‐Amplifizierung zu analysieren. Die isolierten Proben wurden mittels Sanger Technik sequenziert, wobei die Amplifizierung von genetischem Material mittels konventionellem PCR mit den externen Primern des LAMP durchgeführt wurde.

Ergebnisse: Für die isolierten Sporothrix Proben wurde mittels LAMP‐Methode eine Sensibilität von 96,77% gefunden, was durch Sanger Sequenzierung bestätigt wurde. In Bezug auf die Probenmatrix lag das Nachweislimit durch LAMP zwischen 1 und 10 pg von Sporothrix DNA. Die LAMP zeigte bei Verwendung der Blutproben eine Sensibilität von 100%, bei Verwendung der intranasalen Tupfer 77,78% und 92,3% bzw 100% bei den Tupfern bzw Klebestreifenproben der kutanen Läsionen.

Schlussfolgerungen und klinische bedeutung: Diese Ergebnisse unterstützen eine einfache und schnelle LAMP‐basierte Screening Methode, um Sporothrix in isolierten und klinischen Proben nachzuweisen. Dieser zugängliche Test kann beim Management der Krankheit behilflich sein, wenn eine Standardkulturanalyse nicht zur Verfügung steht oder unpraktisch ist.

背景: 孢子丝菌病是由孢子丝菌属真菌引起的一种慢性真菌感染。人畜共患孢子丝菌病主要通过巴西孢子丝菌传播，该病原体通过抓伤、咬伤或接触受污染猫的渗出液而传入。环介导等温扩增 (LAMP) 检测是一种可行的分子检测方法，可用于在兽医资源匮乏的环境中检测孢子丝菌。 假设/目标: 开发一种LAMP方法鉴定孢子丝菌(Sporothrix)，用于识别真菌分离株和家猫(Felis catus)的临床样本，。 材料与方法: 从孢子丝菌分离株以及诊断为孢子丝菌病阳性猫的临床样本中提取DNA。设计了六种LAMP引物，用于扩增申克氏孢子丝菌(S. schenckii)和巴西孢子丝菌(S. brasiliensis)的 28S 核糖体 RNA 区。采用比色法和琼脂糖凝胶电泳法分析LAMP扩增结果。分离株通过桑格技术进行测序，该技术利用LAMP的外部引物，通过常规PCR扩增基因物质。 结果: LAMP方法对分离孢子丝菌样本的灵敏度为96.77%，并经桑格测序证实。根据样本基质的不同，LAMP的检测限为1至10 pg孢子丝菌DNA。LAMP方法对血液样本的灵敏度为100%，对鼻腔拭子样本的灵敏度为77.78%，对皮肤病变拭子和胶带样本的灵敏度分别为92.31%和100%。 结论及临床意义: 这些研究结果支持一种基于LAMP的简单快速筛查工具，用于检测分离株和临床样本中的孢子丝菌。当无法进行或无法进行标准培养分析时，这种便捷的检测方法有助于疾病管理。.

Contexte: La sporotrichose est une infection mycosique chronique causée par des champignons du genre Sporothrix. La sporotrichose zoonotique se produit principalement par la transmission de S. brasiliensis, résultant de l'introduction traumatique de l'organisme par des griffures ou des morsures, ou par le contact avec l'exsudat de chats contaminés. Le test d'amplification isotherme en boucle (LAMP) est une alternative moléculaire viable pour la détection de Sporothrix dans les environnements vétérinaires à faibles ressources. HYPOTHÈSE/OBJECTIFS: Développer une méthode LAMP pour l'identification de Sporothrix à partir d'isolats de champignons et d'échantillons cliniques de chats domestiques (Felis catus). MATÉRIELS ET MÉTHODES: Des échantillons d'ADN ont été prélevés sur des isolats de Sporothrix et des échantillons cliniques de chats positifs pour la sporotrichose. Six amorces LAMP ont été conçues pour amplifier la région de l'ARN ribosomique 28S de S. schenckii et S. brasiliensis. Un test colorimétrique et une électrophorèse sur gel d'agarose ont été utilisés pour analyser l'amplification LAMP. Les échantillons isolés ont été séquencés à l'aide de la technique Sanger, en utilisant l'amplification du matériel génétique par PCR conventionnelle avec les amorces externes de LAMP. RÉSULTATS: La méthode LAMP a permis d'obtenir une sensibilité de 96,77 % pour les échantillons isolés de Sporothrix, confirmée par le séquençage Sanger. La limite de détection de la méthode LAMP se situait entre 1 et 10 pg d'ADN de Sporothrix en fonction de la matrice de l'échantillon. La méthode LAMP a montré une sensibilité de 100 % pour les échantillons de sang, de 77,78 % pour les écouvillons intranasaux et de 92,31 % et 100 % pour les échantillons de lésions cutanées prélevés sur des écouvillons et des rubans adhésifs, respectivement.

Conclusions et pertinence clinique: Ces résultats confirment l'existence d'un outil de dépistage simple et rapide basé sur la méthode LAMP pour détecter Sporothrix dans des échantillons isolés et cliniques. Ce test accessible peut contribuer à la prise en charge de la maladie lorsque l'analyse de la culture standard n'est pas disponible ou n'est pas pratique.

背景: スポロトリコーシスはSporothrix属の真菌によって引き起こされる慢性の真菌感染症である。人獣共通感染症であるスポロトリコーシスは、主にS. brasiliensisの感染によって発症し、ひっかき傷や咬傷、あるいは汚染された猫の滲出液との接触によって、この菌が外傷的に持ち込まれる。LAMP法(loop‐mediated isothermal amplification:ループ媒介等温増幅法)は、獣医療におけるリソースが限られた環境においてSporothrixを検出するための、実行可能な分子学的代替法である。 仮説/目的: 本研究の目的は、真菌分離株と家猫(Felis catus)の臨床サンプルを用いて、Sporothrix同定のためのLAMP法を開発することであった。 材料と方法: Sporothrix分離株およびSporothrix症陽性猫の臨床検体からDNAサンプルを採取した。S. schenckiiおよびS. brasiliensisの28SリボソームRNA領域を増幅する6種類のLAMPプライマーを設計した。LAMP増幅解析には比色測定およびアガロースゲル電気泳動を用いた。分離したサンプルは、LAMPの外部プライマーを用いた通常のPCRによる遺伝物質の増幅を採用し、サンガー法を用いて塩基配列を決定した。 結果: LAMP法を用いた分離Sporothrixサンプルの感度は96.77%であった。LAMP法の検出限界はサンプルマトリックスにより1~10 pgであった。LAMP法の感度は、血液サンプルで100%、鼻腔内スワブで77.78%、皮膚病変のスワブと粘着テープサンプルでそれぞれ92.31%と100%であった。 結論と臨床的意義: これらの知見は、分離サンプルおよび臨床サンプル中のSporothrixを検出するための、簡便かつ迅速なLAMPベースのスクリーニングツールを支持するものであった。この簡便な検査は、標準的な培養検査が利用できない場合や実施できない場合に、疾患の管理に役立つ可能性がある。.

Contexto: A esporotricose é uma infecção micótica crônica causada por fungos do gênero Sporothrix. A esporotricose zoonótica ocorre principalmente pela transmissão de S. brasiliensis, resultante da inoculação traumática do organismo em soluções de continuidade como arranhões ou mordeduras, ou contato com exsudato de gatos contaminados. O ensaio de amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP) é uma alternativa molecular viável para a detecção de Sporothrix em estabelecimentos veterinários com poucos recursos. HIPÓTESE/OBJETIVOS: Desenvolver um método LAMP para identificação de Sporothrix utilizando isolados de fungos e amostras clínicas de gatos domésticos (Felis catus). MATERIAIS E MÉTODOS: Amostras de DNA foram coletadas de isolados de Sporothrix e amostras clínicas de gatos positivos para esporotricose. Seis primers LAMP foram desenvolvidos para amplificar a região 28S do RNA ribossomal de S. schenckii e S. brasiliensis. Ensaio colorimétrico e eletroforese em gel de agarose foram utilizados para analisar a amplificação de LAMP. Amostras isoladas foram sequenciadas pela técnica de Sanger, empregando a amplificação do material genético por PCR convencional com os primers externos de LAMP.

Resultados: Observou‐se uma sensibilidade de 96,77% para amostras isoladas de Sporothrix utilizando o método LAMP, confirmada pelo sequenciamento de Sanger. O limite de detecção de LAMP situou‐se entre 1 e 10 pg de DNA de Sporothrix, de acordo com a matriz da amostra. O LAMP apresentou sensibilidade de 100% em amostras de sangue, 77,78% em swabs intranasais e 92,31% e 100% em amostras de swabs e fitas adesivas de lesões cutâneas, respectivamente. CONCLUSÕES E RELEVÂNCIA CLÍNICA: Estes achados corroboram com a utilização de uma ferramenta de triagem simples e rápida baseada em LAMP para a detecção de Sporothrix em amostras isoladas e clínicas. Este teste acessível pode auxiliar no manejo da doença quando a análise de cultura padrão não estiver disponível ou for impraticável.

INTRODUCCIÓN: La esporotricosis es una infección micótica crónica causada por hongos del género Sporothrix. La esporotricosis zoonótica se produce principalmente por transmisión de S. brasiliensis, como resultado de la introducción traumática del organismo a través de arañazos o mordeduras, o del contacto con exudado de gatos contaminados. El ensayo de amplificación isotérmica mediada por lazos (LAMP) es una alternativa molecular viable para la detección de Sporothrix en entornos veterinarios de bajos recursos. HIPÓTESIS/OBJETIVOS: Desarrollar un método LAMP para la identificación de Sporothrix utilizando aislados de hongos y muestras clínicas de gatos domésticos (Felis catus). MATERIALES Y MÉTODOS: Se obtuvieron muestras de DNA de aislados de Sporothrix y muestras clínicas de gatos positivos para esporotricosis. Se diseñaron seis cebadores LAMP para amplificar la región 28S del RNA ribosómico de S. schenckii y S. brasiliensis. Se utilizó un ensayo colorimétrico y una electroforesis en gel de agarosa para analizar la amplificación de LAMP. Las muestras aisladas se secuenciaron mediante la técnica de Sanger, empleando la amplificación del material genético mediante PCR convencional con los cebadores externos de LAMP. RESULTADOS: Se encontró una sensibilidad del 96,77 % para muestras aisladas de Sporothrix mediante el método LAMP, confirmada mediante secuenciación de Sanger. El límite de detección de LAMP se situó entre 1 y 10 pg de DNA de Sporothrix según la matriz de la muestra. LAMP mostró una sensibilidad del 100 % con muestras de sangre, del 77,78 % con hisopos intranasales y del 92,31 % y del 100 % con muestras de hisopos y cinta adhesiva de lesiones cutáneas, respectivamente. CONCLUSIONES Y RELEVANCIA CLÍNICA: Estos hallazgos apoyan una herramienta de cribado sencilla y rápida basada en LAMP para la detección de Sporothrix en muestras aisladas y clínicas. Esta prueba accesible puede facilitar el manejo de la enfermedad cuando el análisis de cultivos estándar no está disponible o resulta poco práctico.

Keywords: Sporothrix; LAMP loop‐mediated isothermal amplification; mycoses.

PubMed Disclaimer

Conflict of interest statement

The authors declare no conflicts of interest.

Figures

FIGURE 1
FIGURE 1
Sporothrix identification and loop‐mediated isothermal amplification (LAMP) assay characterisation. (a) Sporothrix identification via fungal culture and morphological analysis, represented by a microscopy image of the characteristic flower‐like conidia arrangement. (b) Colorimetric LAMP assay results for Sporothrix isolates obtained from cats diagnosed with sporotrichosis. (c) Limit of detection (LOD) for the colorimetric LAMP assay using Sporothrix DNA templates (ranging from 10 to 10−5 ng) and gel electrophoresis analysis of the assay products. Colour interpretation: pink represents negative reactions, while yellow or orange indicates positive LAMP amplification. NTC, nontarget control.
FIGURE 2
FIGURE 2
Sporothrix detection in blood and cutaneous lesions from feline clinical samples. (a) A cat with sporotrichosis presenting characteristic cutaneous lesions. (b) Limit of the colorimetric loop‐mediated isothermal amplification (LAMP) assay detection using Sporothrix DNA templates (ranging from 1 to 10−4 ng) in a blood matrix, along with gel electrophoresis analysis of the LAMP assay products. (c) Colorimetric LAMP assay results for blood samples collected from cats positive for sporotrichosis, targeting the 28S ribosomal RNA region of S. brasiliensis and S. schenckii. (d) Colorimetric LAMP assay results for swab samples collected from cutaneous lesions of cats positive for sporotrichosis. (e) Colorimetric LAMP assay results for adhesive tape samples collected from cutaneous lesions of cats positive for sporotrichosis. Colour interpretation: pink represents negative reactions, while yellow or orange indicates positive LAMP amplification.
FIGURE 3
FIGURE 3
Sporothrix detection in nasal discharge samples from feline clinical cases. (a) A cat diagnosed with sporotrichosis exhibiting characteristic nasal lesions associated with the disease. (b) Colorimetric loop‐mediated isothermal amplification (LAMP) assay results for intranasal discharge samples collected from cats positive for sporotrichosis. Colour interpretation: pink represents negative reactions, while yellow or orange indicates positive LAMP amplification.
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References

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